MIOSTATINA ȘI CĂILE DE SEMNALIZARE ALE HIPERTROFIEI MUSCULARE

Mușchiul scheletic este cel mai abundent țesut din corpul vertebratelor. Metabolismul său influențează echilibrul metabolic al întregului organism și reprezintă principala rezervă de proteine a corpului. Este un țesut plastic care se adaptează continuu ca răspuns la o varietate de stimuli, inclusiv utilizare și neutilizare. De exemplu, încărcarea mecanică produce hipertrofie, în timp ce inactivitatea fizică duce la atrofie. Este important de menționat că pierderea masei musculare este observată după traumatisme musculoscheletice, în timpul îmbătrânirii, în tulburări neuromusculare și în multe boli catabolice, precum cancerul, diabetul, insuficiența renală, insuficiența respiratorie sau sepsisul.

Masa musculară este rezultatul unui echilibru dinamic între sinteza și degradarea proteinelor. Acest echilibru este reglat în mod coordonat de două ramuri principale ale căilor de semnalizare AKT: calea AKT (cunoscută și ca protein kinaza B)/mTOR, care controlează sinteza proteinelor, și calea AKT/FOXO, care controlează degradarea proteinelor. În ultimii ani, miostatina, un membru al superfamiliilor TGFβ, a devenit un regulator-cheie al masei musculare scheletice. Deleția sau pierderea funcției sale induce o creștere excesivă a mușchilor, în timp ce supraexpresia sau administrarea sistemică a acesteia provoacă atrofie musculară. Este important faptul că celulele musculare scheletice mature răspund la miostatină, astfel că potențialele aplicații clinice ale inhibitorilor de miostatină sunt în prezent studiate. Prin urmare, o înțelegere mai profundă a mecanismelor moleculare care determină hipertrofia musculară scheletică în urma inhibării sau pierderii miostatinei este necesară pentru investigarea abordărilor terapeutice potențiale.

Identificarea factorilor de semnalizare care reglează echilibrul proteic al mușchiului scheletic a oferit oportunitatea de a determina modul în care miostatina influențează acest proces. O cantitate mare de date a evidențiat o interacțiune între miostatină și calea intracelulară AKT/mTOR și susține puternic ideea că miostatina afectează echilibrul proteic al mușchiului prin reglarea sintezei și degradării proteinelor. O mare parte din cercetări s-au concentrat pe investigarea modului în care inhibarea miostatinei duce la hipertrofia mușchiului scheletic în timpul dezvoltării și în mușchiul adult, unde inhibarea miostatinei ar putea promova hipertrofia independent de celulele satelit. Mai mult, miostatina reglează asamblarea complexului de preinițiere a translației în celulele musculare scheletice, sugerând un potențial control al eficienței traducerii. Miostatina, de asemenea, reduce fosforilarea Akt și semnalează prin factorii de transcripție FOXO pentru a crește expresia genelor asociate atrofiei (atrogene) și pentru a induce atrofia, sugerând o potențială legătură moleculară funcțională între semnalizarea miostatinei și reglarea proteolizei. Aceste descoperiri dezvăluie un rol central al miostatinei în conectarea căilor de semnalizare celulare care reglează răspunsurile anabolice și catabolice din mușchi. Având în vedere rolul său central, scopul acestei analize este de a evidenția întrebările importante încă deschise despre reglarea căilor de semnalizare anabolice și catabolice opuse de către miostatină. Vom discuta cazurile cunoscute de coreglare între miostatină, căile de promovare a creșterii și sistemele proteolitice, concentrându-ne pe mecanismele hipertrofiei musculare din avalul inhibării miostatinei și pe rolul emergent al miostatinei în reglarea translației.

Miostatina: un modulator important al homeostaziei musculare
Lecții din invalidarea genetică a miostatinei

Miostatina inhibă puternic dezvoltarea masei musculare. Într-adevăr, eliminarea genei miostatinei duce la o creștere musculară excesivă la șoareci. Comparativ cu animalele de tip sălbatic, mușchii scheletici ai șoarecilor de 5 luni la care gena miostatinei a fost ablată genetic (Mstn −/−) sunt mult mai grei (până la 260 % creștere în greutate pentru mușchiul pectoral), datorită creșterii atât a numărului de fibre musculare (hiperplazie), cât și a ariei secțiunii transversale (hipertrofie). Mutările naturale ale genei miostatinei duc la un fenotip hipermuscular la șoareci, oi, câini, oameni și la anumite rase de bovine. Miostatina joacă, de asemenea, un rol fundamental în reglarea creșterii și dimensiunii mușchiului adult. De exemplu, eliminarea genei miostatinei sau inhibarea acesteia în viața postnatală amplifică dezvoltarea musculară și crește masa musculară.

Calea de semnalizare a miostatinei

Diferitele componente ale căii de semnalizare a miostatinei au fost definite de Rebbapragada și colaboratorii. Dimerul matur C-terminal al miostatinei se leagă de unul dintre cei doi receptori activinici de tip II (ActRIIB într-o măsură mai mare decât ActRIIA), care recrutează, fosforilează și activează astfel receptorii activinici de tip I (ALK4 și ALK5), ceea ce duce la fosforilarea și activarea proteinelor Smad2 și Smad3. Smad2 și Smad3 fosforilate formează un complex heterodimeric cu mediatorul comun Smad4. Aceste proteine Smad activate funcționează ca mediatori intracelulari esențiali ai semnalizării miostatinei, deoarece se translocă în nucleu și activează transcrierea genelor-țintă prin interacțiunea cu ADN-ul și alți factori nucleari. Un nivel suplimentar de complexitate este reprezentat de faptul că semnalizarea miostatinei este controlată de un alt membru al familiei Smad, proteina inhibitorie Smad7. După stimularea prin miostatină, Smad7 acționează ca un inhibitor cu feedback negativ al căii de semnalizare a miostatinei. De fapt, Smad7 inhibă expresia genei miostatinei și interferează, de asemenea, cu formarea complexului Smad2/3–Smad4, ducând la inhibarea semnalizării miostatinei.

Mai multe studii au arătat că inhibarea diferitelor componente ale căii miostatină–ActRIIB–ALK4/ALK5–Smad2/3 promovează hipertrofia musculară la vârsta adultă, descrisă pe larg în secțiunea „Interacțiunea dintre miostatină și căile de semnalizare Akt/mTOR în controlul sintezei proteinelor”. Interesant este că un studiu recent a stabilit faptul că hipertrofia musculară a șoarecilor Mstn−/− depinde de semnalizarea proteinelor morfogenetice osoase (BMP). Autorii au arătat că semnalizarea BMP este dominantă asupra semnalizării miostatinei în controlul hipertrofiei musculare. În realitate, inhibarea semnalizării BMP a provocat atrofie musculară și a abolit fenotipul hipertrofic al șoarecilor Mstn −/−, indicând că fenotipul hipertrofic cauzat de inhibarea miostatinei rezultă din semnalizarea BMP neîngrădită.

Miostatina ca țintă a acțiunii semnalelor anabolice în mușchi

Interesant este faptul că mai multe studii au stabilit o legătură între miostatină și semnalele anabolice (substanțe anabolice, antrenament de rezistență), sugerând implicarea miostatinei în hipertrofia musculară mediată de stimuli anabolici.

Administrarea pe termen lung (18 luni) a hormonului de creștere (GH) reduce nivelurile de miostatină în mușchi la pacienți adulți hipopituitari cu deficit de GH, iar acest lucru este asociat cu o creștere a masei corporale slabe. În mod similar, nivelurile de ARNm și de proteină ale miostatinei sunt reduse în celulele musculare scheletice cultivate după incubarea cu GH. Aceste date sugerează că GH ar putea exercita acțiunea sa anabolică prin reglarea în jos a miostatinei. Totuși, tratamentul cu GH la bărbați sănătoși (1 lună) nu a modificat expresia ARNm a miostatinei și nici masa corporală slabă. Deși această discrepanță poate reflecta diferențe între populațiile studiate și durata tratamentului cu GH, ea sugerează, de asemenea, că efectul inhibitor al GH asupra expresiei miostatinei ar putea fi secundar creșterii masei musculare, mai degrabă decât direct.

Alte studii au evidențiat o relație între efectele anabolice ale androgenilor și miostatină. Androgenii reglează negativ expresia miostatinei în mușchiul levator ani, dependent de androgeni, la șobolani. Mai mult, androgenii ar putea regla expresia genei miostatinei și indirect. De exemplu, follistatina (FS), un regulator negativ al miostatinei, este suprareglată după tratamentul cu testosteron atât în celulele satelit, cât și în mușchi, sugerând că inhibarea miostatinei de către FS poate contribui la efectul hipertrofic al androgenilor. Astfel, efectul miogenic al androgenilor ar putea fi, cel puțin parțial, mediat prin suprimarea expresiei și activității miostatinei. Pe de altă parte, Dubois și colaboratorii au identificat multiple elemente de răspuns la androgeni (ARE) în promotorul miostatinei și au demonstrat că expresia miostatinei este stimulată de androgeni direct la nivel transcripțional. Deși această reglare pozitivă pare în contradicție cu bine-cunoscuta acțiune anabolică a androgenilor în mușchi, inducerea miostatinei prin androgeni ar putea reprezenta un mecanism contrareglator pentru a preveni o hipertrofie excesivă. În sprijinul acestei ipoteze, aceiași autori au raportat că hipertrofia musculară ca răspuns la androgeni este amplificată la șoarecii Mstn −/−.

În concordanță cu rolul miostatinei ca regulator negativ al dimensiunii musculare, mai multe studii au arătat că antrenamentul de forță cu rezistență mare este asociat cu reglarea în jos a expresiei miostatinei. De exemplu, antrenamentul de rezistență pe termen lung sau o singură sesiune acută de exercițiu de rezistență reprimă nivelurile bazale de ARNm ale miostatinei la rozătoare și oameni. Aceste date sugerează existența unei corelații inverse între hipertrofia indusă de exercițiu și nivelurile de ARNm ale miostatinei. Totuși, Willoughby și colaboratorii au găsit niveluri crescute de ARNm al miostatinei musculare și niveluri crescute de proteină a miostatinei serice după antrenamentul de rezistență intens la oameni. Discrepanța dintre aceste studii in vivo poate fi legată de modul de exercițiu și/sau momentul recoltării probelor. Într-adevăr, Roth și colaboratorii au prelevat probe la 48–72 de ore după ultima sesiune de antrenament pentru a se asigura că a fost examinat un nivel bazal al miostatinei, în timp ce Willoughby și colaboratorii au măsurat nivelurile imediat după sesiunea finală de antrenament. Acest lucru ar putea sugera că modificări opuse ale nivelurilor de miostatină pot apărea în timpul exercițiului de rezistență: o creștere timpurie a miostatinei pentru a promova remodelarea celulară, urmată de o expresie bazală redusă, ducând la hipertrofie musculară.

Indiferent de mecanismele prin care miostatina modulează masa musculară ca răspuns la stimuli anabolici, toate aceste date sugerează cu tărie că miostatina ar putea fi o țintă a cascadelo de semnalizare care reglează hipertrofia mușchiului scheletic.

Miostatină: un rol critic în atrofie

Descoperirile mai multor grupuri indică faptul că expresia genei miostatinei este crescută în condiții fiziopatologice care duc la pierderea masei musculare. De exemplu, reglarea în sus a proteinei miostatinei este observată în timpul atrofiei induse de hipoxie la șobolani, la pacienți hipoxemici cu boală pulmonară obstructivă cronică (BPOC) severă și în miotuburi umane tratate cu agenți care imită hipoxia. Acest lucru sugerează un potențial rol al miostatinei în disfuncția musculară scheletică din BPOC. În plus, diferite studii care au comparat masa musculară la oameni cu sarcopenie (pierderea de masă musculară asociată vârstei) au raportat rezultate divergente, variind de la o corelație inversă între nivelurile serice de miostatină și pierderea masei musculare, până la lipsa oricărui efect. Dacă miostatina este sau nu implicată în pierderea musculară asociată vârstei este dificil de investigat la oameni. Totuși, există unele dovezi că inhibarea miostatinei protejează împotriva pierderii „normale” de masă musculară la animalele îmbătrânite. Într-adevăr, șoarecii Mstn −/− prezintă o sarcopenie redusă comparativ cu cei sălbatici, iar inhibarea miostatinei mediată de anticorpi atenuează atrofia fibrelor musculare, îmbunătățește capacitatea funcțională musculară și reduce apoptoza în mușchii scheletici ai șoarecilor îmbătrâniți.

Alte rapoarte indică faptul că miostatina nu este necesară în toate condițiile care duc la atrofie. Într-adevăr, conținutul de miostatină este neschimbat în atrofia musculară apărută după denervare sau suspendarea membrelor posterioare. Trebuie menționat că variațiile nivelurilor de miostatină în timpul fazei catabolice pot complica interpretarea acestor rezultate. De exemplu, în studiul lui Carlson, ARNm-ul miostatinei a fost crescut la 24 de ore după suspendarea membrelor posterioare; totuși, în etapele ulterioare (când a fost observată o atrofie musculară semnificativă), nivelul de ARNm al miostatinei nu a fost semnificativ diferit între animalele experimentale și cele de control, sugerând o reglare tranzitorie în sus a nivelului de ARNm al miostatinei în timpul pierderii musculare. În plus, interpretarea acestui studiu este complicată de faptul că a utilizat cantitățile de ARNm ca estimare a expresiei miostatinei. Aceasta este o evaluare foarte indirectă și nu se poate exclude modularea nivelului și activității miostatinei prin reglări la nivel translational sau post-translational.

În concluzie, heterogenitatea acestor studii, având în vedere diversitatea modelelor, evoluția temporală și intensitatea stimulilor, complică și mai mult interpretarea rezultatelor. Această complexitate subliniază importanța unor studii suplimentare pentru clarificarea rolului miostatinei în pierderea musculară, în vederea dezvoltării unor noi abordări terapeutice. Totuși, o problemă importantă care trebuie abordată este dacă miostatina este necesară sau joacă doar un rol de reglare în progresia atrofiei musculare.

Relevante pentru bolile cu pierdere musculară, inhibarea miostatinei contracarează atrofia musculară la șoarecii deficienți în caveolin-3, iar eliminarea miostatinei protejează împotriva pierderii musculare induse de dexametazonă prin reducerea proteolizei induse de glucocorticoizi comparativ cu șoarecii sălbatici. Mai mult, efectul protector al glutaminei împotriva atrofiei induse de glucocorticoizi la șoareci este asociat cu o scădere a expresiei miostatinei. Astfel, miostatina pare a fi o țintă terapeutică promițătoare împotriva pierderii musculare. O dovadă directă a rolului miostatinei în atrofia musculară a fost adusă de Zimmers și colaboratori, care au arătat că supraexprimarea miostatinei la șoarecii adulți induce o pierdere musculară comparabilă cu sindroamele de cașexie umană. Important este faptul că atrofia musculară la acești șoareci a putut fi redusă prin administrarea sistemică de pro-peptidă a miostatinei sau de FS, doi inhibitori ai miostatinei, indicând că pierderea musculară observată a fost cauzată de excesul de miostatină. În mod similar, supraexprimarea miostatinei duce la reducerea masei musculare la șobolani prin inducerea reglării în jos a genelor musculare specifice (gene structurale musculare și factori miogenici). Colectiv, aceste date sugerează că miostatina joacă un rol în atrofia musculară.

Cu toate acestea, situația a fost complicată de studiul lui McMahon și colaboratorilor, care a raportat că pierderea masei musculare este mai pronunțată la șoarecii Mstn −/− decât la cei sălbatici în timpul suspendării membrelor posterioare. Acest lucru indică faptul că absența miostatinei nu protejează împotriva atrofiei musculare și sugerează, de asemenea, că rolul miostatinei ar putea fi acela de a inhiba hipertrofia mai degrabă decât de a induce atrofia. În ansamblu, aceste rezultate demonstrează că miostatina probabil nu este cauza principală a atrofiei musculare. În concluzie, în ciuda progreselor în înțelegerea rolului miostatinei în atrofia musculară, mecanismele implicate în reglarea și acțiunile miostatinei în toate formele de atrofie musculară rămân de clarificat.

Reglarea miostatinei asupra creșterii mușchiului scheletic

Rolul miostatinei în biologia musculară este complex și include reglarea atât a numărului, cât și a dimensiunii fibrelor musculare scheletice.

Miostatina controlează biologia celulelor musculare scheletice

Activarea celulelor satelit

Dincolo de rolul său în timpul dezvoltării musculare, este clar acum că miostatina reglează și creșterea și dimensiunea mușchiului la adulți. La organismele adulte, mușchiul scheletic este alcătuit în principal din fibre musculare scheletice care sunt terminal diferențiate și incapabile să se dividă. Prin urmare, creșterea musculară la adult se datorează în principal creșterii conținutului proteic prin activarea căii AKT/mTOR, care reglează sinteza proteinelor. Totuși, acumularea de noi nuclee furnizate de celulele stem musculare, numite celule satelit, pare să fie necesară pentru creșterea miofibrelor post-mitotice.

În timpul dezvoltării, mioblaștii derivați din celulele satelit proliferează și se diferențiază, apoi se fuzionează cu miofibrele existente pentru a le mări dimensiunea. Unele date sugerează că celulele satelit pot contribui și la hipertrofia musculară după pierderea miostatinei. Într-adevăr, numărul de celule satelit în stare bazală raportat la unitatea de fibră musculară și proporția de celule satelit activate sunt semnificativ mai mari la șoarecii adulți Mstn −/− decât la cei de tip sălbatic. În mod similar, injecția de shRNA-uri împotriva miostatinei la șobolani crește numărul de celule satelit de peste două ori. In vitro, celulele satelit de la șoarecii Mstn −/− proliferează și se diferențiază mai rapid decât cele de la șoarecii de tip sălbatic.

Totuși, alte studii au ajuns la concluzii opuse și au raportat că nu există diferențe în numărul și rata de proliferare a celulelor satelit între șoarecii Mstn −/− și cei de tip sălbatic. În concordanță cu aceste rezultate, inactivarea miostatinei după dezvoltare duce la hipertrofie fără acumulare de noi mio-nuclee, iar hipertrofia musculară indusă de inhibarea miostatinei/activinei A apare și la șoarecii Sdc4 −/− sau Pax7 −/−, la care activitatea celulelor satelit este deficitară. In vitro, mio-tuburile cultivate de la șoarecii Mstn −/− sunt mai mari decât cele de tip sălbatic, în timp ce numărul de nuclee rămâne constant. Aceste constatări sugerează că dimensiunea mai mare a domeniului mio-nuclear observată în absența miostatinei este rezultatul creșterii volumului citoplasmatic și nu al fuziunii mioblaștilor.

În cele din urmă, inhibarea miostatinei folosind receptorul activinei de tip IIB solubil la șoarecii adulți activează celulele satelit; cu toate acestea, în acest model, hipertrofia fibrelor musculare precede incorporarea noilor nuclee. Astfel, inhibarea miostatinei ar putea induce hipertrofie prin creșterea raportului citoplasmă/mio-nucleu înainte de activarea celulelor satelit.

Proliferarea și diferențierea celulară

Semnalizarea miostatinei modulează expresia genelor țintă, precum cele implicate în controlul proliferării mioblaștilor și al diferențierii terminale. Incubarea cu miostatină recombinantă poate bloca celulele musculare cultivate (precum mioblaștii C2C12, mioblaștii bovini primari și celulele satelit de șoarece) în faza G1 a ciclului celular. În schimb, inhibarea miostatinei, folosind un plasmid antisens pentru miostatină, stimulează proliferarea și diferențierea mioblaștilor C2C12.

Acțiunea antiproliferativă a miostatinei este asociată cu creșterea expresiei p21, un inhibitor al kinazelor dependente de ciclină, și cu scăderea ulterioară a nivelurilor de CDK2, CDK4 și ale proteinei retinoblastom fosforilate. Un mecanism prin care miostatina reduce activitatea CDK4 și fosforilarea RB este prin reglarea ciclului D1, un inhibitor cunoscut al miogenezei. Mai mult, miostatina favorizează inhibarea AKT, activarea GSK-3β și destabilizarea ciclului D1, iar acest proces depinde de receptorul activinei de tip IIB, dar nu de SMAD3.

Miostatina a fost de asemenea implicată în reglarea negativă a activării și auto-reînnoirii celulelor satelit prin scăderea expresiei PAX7.

Ilustrație schematică a controlului exercitat de miostatină asupra dezvoltării mușchiului scheletic și a creșterii postnatale

Diferențierea celulelor musculare scheletice necesită în mod secvențial oprirea creșterii, urmată de debutul expresiei coordonate a genelor specifice musculare. Ieșirea din ciclul celular și fiecare fază a diferențierii sunt coordonate prin activarea unor cicluri specifice, kinaze dependente de ciclină, inhibitori ai acestora și factori reglatorii miogenici, care duc la inducerea proteinelor musculare specifice, cum ar fi lanțurile grele de miozină.

Panoul superior
În timpul fazei de proliferare, miostatina poate crește nivelul p21, un inhibitor al kinazelor dependente de ciclină și, ca urmare, nivelurile CDK2, CDK4 și ale proteinei RB fosforilate scad, conducând la oprirea ciclului celular. Miostatina inhibă suplimentar diferențierea prin scăderea factorilor reglatorii miogenici, precum MyoD și miogenina, și a factorului de transcripție PAX3. Blocarea proteinei RAPTOR facilitează, de asemenea, inhibarea diferențierii musculare de către miostatină.

Panoul inferior
Miostatina contribuie, de asemenea, la inhibarea activării celulelor satelit și a auto-reînnoirii acestora în celulele musculare mature, prin scăderea factorului de transcripție PAX7.

În plus față de oprirea prematură a ciclului celular, miostatina controlează și programul de diferențiere miogenică

Miostatina reglează diferențierea mioblaștilor prin inhibarea factorilor reglatorii miogenici, precum Pax3, MyoD și Myf5. Mai mult, exprimarea unei forme dominante negative a proteinei SMAD3 este suficientă pentru a restabili activitatea unui vector reporter bazat pe promotorul genei MyoD în mioblaștii C2C12 tratați cu miostatină recombinantă.

A fost raportată existența unui mecanism de feedback negativ între factorii miogenici și miostatină, deoarece factorii miogenici MyoD și Myf5 induc activarea promotorului genei miostatinei. Suprarexpresia sau adăugarea de miostatină la celulele C2C12 inhibă diferențierea mioblaștilor prin scăderea expresiei genelor MyoD și miogenină prin intermediul căii MEK/Erk1/2, iar această cale MAPK poate juca un rol foarte important în suprimarea diferențierii miogenice mediate de miostatină.

În cele din urmă, miostatina inhibă activarea AKT în mioblaștii și miotuburile umane, iar inhibarea prin siRNA a proteinei RAPTOR, o componentă a complexului de semnalizare mTORC1, contribuie la inhibarea genelor induse în timpul diferențierii musculare. Prin urmare, efectul anti-diferențiere al miostatinei este cel puțin parțial mediat de perturbarea semnalizării AKT/mTORC1.

Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că miostatina acționează prin mai multe căi de semnalizare pentru a controla proliferarea și diferențierea mioblaștilor angajați.

Reglarea funcției de supraviețuire celulară

Alte date sugerează o contribuție a miostatinei în înclinarea balanței supraviețuire/apoptoză în favoarea supraviețuirii celulare. Analizele transcriptomice și proteomice au arătat că șoarecii Mstn −/− prezintă modificări ale expresiei genelor și proteinelor implicate în căile de supraviețuire și apoptoză.

De fapt, scăderea unor factori, precum cristalină alfa B6 sau proteina de șoc termic 9A, și creșterea altora, precum Dad1, survivin, TCTP și 14-3-3E, ar putea reprezenta o semnătură a creșterii supraviețuirii celulare și a proceselor anti-apoptotice. Mai mult, procentul de nuclee apoptotice, activitatea caspazelor 3, 8 și 9 și abundența țintelor și regulatorilor acestora sunt reduse în mușchii șoarecilor Mstn −/− comparativ cu animalele de tip sălbatic. În mod similar, inhibarea acută a miostatinei cu anticorpi reduce apoptoza în mușchiul tibialis al șoarecilor în vârstă.

Aceste constatări ridică ipoteza că inhibarea sau absența miostatinei ar putea promova supraviețuirea celulară, limitând astfel pierderea de nuclee musculare și crescând dimensiunea domeniului nucleo-citoplasmatic, un factor-cheie în hipertrofia musculară. Totuși, studiile efectuate pe mioblaști în cultură nu susțin pe deplin ideea că miostatina ar fi un regulator direct al apoptozei musculare.

În orice caz, sunt necesare experimente suplimentare pentru elucidarea mecanismului care stă la baza hipertrofiei induse de inhibarea miostatinei.

În concluzie, reglarea dimensiunii mușchiului scheletic de către miostatină pare să implice, pe de o parte, acțiunea sa negativă asupra proliferării și diferențierii mioblaștilor angajați, iar pe de altă parte, reglarea turnover-ului proteic.

Miostatina funcționează la intersecția dintre căile de semnalizare ale sintezei și degradării proteinelor în mușchi

Interacțiunea dintre miostatină și căile de semnalizare Akt/mTOR în controlul sintezei proteinelor

Semnalizarea prin calea fosfatidil-inozitol 3-kinazei AKT/mTOR controlează sinteza proteinelor și hipertrofia musculară la adulți. Exprimarea unei forme constitutiv active a AKT în mușchiul scheletic duce rapid la hipertrofie musculară. Constatarea că inhibarea mTOR antagonizează efectul de creștere promovat de AKT sugerează că AKT acționează în principal prin activarea mTOR.

mTOR formează două complexe mari împreună cu RAPTOR sau RICTOR. Complexul mTORC1 reglează direct sinteza proteinelor și este sensibil la rapamicină. Efectul mTORC1 asupra mașineriei de traducere și sintezei proteice este mediat prin inhibarea proteinei 4E-BP1 și activarea kinazei ribozomale S6. Astfel, mTORC1 induce sinteza proteinelor prin fosforilarea și inhibarea 4E-BP1 și prin eliberarea factorului eIF4E și a traductiei dependente de cap. De asemenea, reglează biogeneza ribozomilor prin cel puțin două mecanisme:

fosforilarea proteinei ribozomale S6 de către S6K1, care stimulează traducerea ARNm-urilor ce conțin un segment 5’-oligopirimidinic
modularea sintezei ARN-ului ribozomal.

Calea mTOR/mTORC1 pare să coordoneze schimbările în eficiența traducerii, definită ca sinteza proteică raportată la unitatea de ARN, și în capacitatea de traducere, definită ca numărul total de ribozomi raportat la unitatea de țesut.

Dovezi privind comunicarea între miostatină și căile AKT/mTOR

Mai multe linii de dovezi susțin existența unei interacțiuni între miostatină și căile AKT/mTOR. Analizele transcriptomice și proteomice au arătat că această cale este suprareglată în absența miostatinei la șoareci și bovine. În mușchiul scheletic hipertrofiat al șoarecilor Mstn −/−, componentele AKT/mTOR sunt mai active decât la animalele sălbatice.

Studiile de tip „câștig și pierdere de funcție” au arătat ulterior că miostatina inhibă activarea căii AKT/mTOR. La șobolanii neonatali, inhibarea miostatinei prin infuzie de FS crește sinteza proteinelor musculare, iar acest efect este corelat cu creșterea nivelului S6K și fosforilarea rpS6. Sinteza proteică crescută a fost observată și la șoareci adulți de tip sălbatic tratați cu anticorpi anti-miostatină, precum și la șoarecii Mstn −/−.

Transferul electro-genic al genei miostatinei în mușchiul adult este asociat cu scăderea căii AKT/mTOR, evidențiată prin reducerea fosforilării AKT, rpS6, p70S6K și 4E-BP1, fără efect asupra căilor de proteoliză musculară. În cultură celulară, supraexpresia miostatinei atenuează hipertrofia miotuburilor indusă de IGF-1, în timp ce inhibarea miostatinei promovează hipertrofia dependentă de AKT. Tratarea miotuburilor umane cultivate cu miostatină suprimă calea AKT/mTOR, ducând la inhibarea diferențierii musculare și la reducerea dimensiunii miotuburilor mature.

Baza moleculară a conexiunii dintre miostatină și AKT

Inhibarea activității miostatinei mediată de supraexpresia unui receptor activin de tip IIB dominant-negativ promovează hipertrofia musculară prin semnalizarea mTOR. În plus, inhibarea factorilor de transcripție SMAD2 și SMAD3, situate în aval de miostatină, în mușchiul scheletic al șoarecilor adulți, promovează de asemenea hipertrofia. Interesant, acest mecanism depinde parțial de semnalizarea mTORC1.

Inhibarea mTOR prin rapamicină și prin RNAi reduce parțial efectul hipertrofic al blocării activității miostatinei, aproximativ cu 35–40%. Acest rezultat este în concordanță cu observațiile conform cărora rapamicina nu previne stimularea sintezei proteice musculare indusă de un anticorp anti-miostatină.

În ansamblu, aceste studii indică faptul că miostatina și calea AKT comunică la diferite niveluri și sugerează că miostatina ar putea fi o moleculă-cheie în controlul metabolismului proteic.

Reglarea miostatinei și translația

Studiul nostru oferă informații noi importante privind legătura dintre miostatină și mecanismele de translație. Folosind un model in vitro de celule satelit cultivate, provenite de la șoareci Mstn −/−, am demonstrat recent că factorii de translație sunt recrutați în complexele de legare la capătul 7-metil-guanozină mai eficient în celulele Mstn −/− decât în celulele martor, în timp ce adăugarea de miostatină inhibă acest proces. Este astfel rezonabil să presupunem că inhibarea miostatinei duce la hipertrofie musculară prin afectarea eficienței de translație a unor ARNm musculare specifice. De exemplu, am arătat că deleția miostatinei este asociată cu creșterea expresiei proteinelor AKT, mTOR și rpS6, dar nu și a expresiei lor la nivel de ARNm, sugerând că miostatina ar putea controla translația unui subset specific de ARNm care fac parte dintr-un punct de control al creșterii în celulele musculare.

Alternativ, miostatina ar putea acționa direct asupra unor regulatori ai eficienței translației care, la rândul lor, ar putea influența translația unor ARNm specifice. Într-adevăr, mai multe gene care codifică factori de inițiere și elongare ai translației sunt supraexprimate în mușchiul șoarecilor tineri Mstn −/−. În plus, supraexpresia unor componente ale mecanismului de translație, cum ar fi factorul de inițiere al translației eucariote 3-subunitatea F eIF3F sau factorul de inițiere al translației eucariote 2B-epsilon eIF2Be, induce aceeași creștere a translației dependente de cap și aceeași hipertrofie a mușchiului scheletic observată în urma inactivării miostatinei, sugerând că efectul miostatinei asupra sintezei proteice ar putea fi indirect.

După inițierea translației, capacitatea de translație depinde de nivelul ribozomilor funcționali din celulă. Transcrierea genelor ribozomale este un pas limitativ major în biogeneza ribozomilor. Dovezile prezentate de Welle și colaboratorii sugerează că miostatina contribuie la reglarea capacității de translație. Mai exact, sinteza proteică și conținutul de ARN per mușchi sunt mai mari la șoarecii deficienți în miostatină față de animalele sălbatice. În concordanță, conținutul total de ARN, formarea de polizomi și sinteza proteică sunt toate crescute în miofibrele Mstn −/− cultivate. Împreună, aceste date indică faptul că efectele miostatinei asupra sintezei proteice pot afecta atât biogeneza ribozomilor, cât și eficiența translației anumitor subclase de ARNm.

Ilustrație schematică a rolurilor miostatinei în sinteza și degradarea proteinelor

Mai întâi, calea miostatină–SMAD modifică activitatea kinazei proteice AKT, inhibând astfel asamblarea complexului de inițiere a translației și sinteza proteică. AKT blochează translocarea nucleară a FOXO pentru a inhiba exprimarea MAFbx și MuRF1 și, în consecință, degradarea proteinelor. În al doilea rând, miostatina suprimă și calea AKT și semnalează prin factorii de transcripție FOXO pentru a crește degradarea proteinelor prin activitatea sistemului ubiquitină–proteazom. În final, miostatina ar putea inhiba și sistemul autofagie–lizozom.

Miostatina și căile de semnalizare implicate în degradarea proteinelor

Rolul miostatinei în degradarea proteinelor nu este încă bine înțeles. Atrofia musculară este caracterizată prin scăderea diametrului și a conținutului total de proteine ale miofibrelor și este rezultatul unei sinteze proteice reduse și al unei degradări și turnover accelerat al proteinelor.

În mai multe tipuri celulare, factorii de transcripție FOXO sunt mediatori-cheie ai răspunsului catabolic în timpul atrofiei și coordonează activarea celor două cele mai importante mecanisme proteolitice celulare: sistemele autofagie–lizozom și ubiquitină–proteazom. Activitatea FOXO este suprimată de fosforilarea mediată de AKT, prevenind astfel exprimarea atrogenelor precum MAFbx/Atrogin-1 și MuRF-1, două ligaze ubiquitinice esențiale în atrofie.

Există dovezi că miostatina poate induce atrofie musculară parțial prin activarea sistemului ubiquitină–proteazom. McFarlane și colaboratorii au raportat că, în celulele musculare C2C12 cultivate, tratamentul cu miostatină blochează calea IGF1/PI3K/AKT și activează FOXO1, ceea ce duce la creșterea expresiei MAFbx și MuRF-1. Interesant, FOXO1 poate crește exprimarea miostatinei, sugerând un mecanism de feedback sinergic care amplifică răspunsul atrofie.

Reglarea ascendentă a atrogenelor mediată de miostatină a fost ulterior observată și în miotuburi umane.

Cu toate acestea, Trendelenburg și colaboratorii au raportat că miostatina reduce diametrul miotuburilor HuSkMC mature și reduce activitatea căii AKT, dar nu induce ligazele E3 ubiquitinice MuRF1 și MAFbx. De fapt, aceste gene au fost reduse împreună cu myogenina și MyoD, rezultat în concordanță cu efectul anti-diferențiere al miostatinei.

Aceste rezultate pun sub semnul întrebării implicarea miostatinei în inactivarea axei AKT/mTOR și în inducerea atrogenelor și sugerează că, în miotuburile post-diferențiate, miostatina cauzează scăderea diametrului fibrelor fără a activa „calea clasică a atrofiei”. Într-adevăr, miostatina ar putea reduce masa musculară prin inhibarea expresiei genelor necesare pentru menținerea musculaturii.

Demn de menționat este faptul că în mușchii șoarecilor Mstn −/−, nivelul proteinei MAFbx și lanțul greu de miozină ubiquitinat sunt ambele reduse, sugerând o activitate scăzută a sistemului ubiquitină–proteazom comparativ cu mușchii sălbatici. În schimb, Amirouche și colaboratorii au raportat că supraexpresia miostatinei în mușchi nu modifică activitatea sistemului ubiquitină–proteazom. Similar, adăugarea de miostatină recombinantă la miotuburi C2C12 a redus sinteza proteică fără a afecta rata proteolizei.

În concluzie, contribuția directă a miostatinei în declanșarea expresiei atrogenelor și a degradării proteinelor in vivo nu a fost încă determinată precis. Deși studiile in vivo nu susțin ideea că miostatina induce expresia MAFbx sau MuRF1, mai multe dovezi indică faptul că, odată ce proteoliza este stimulată, inhibarea miostatinei poate reduce proteoliza.

Puține studii au investigat legătura dintre miostatină și sistemul autofagie–lizozom. În celulele C2C12, miostatina poate stimula formarea autofagozomilor și exprimarea mai multor gene implicate în autofagie. Mai mult, un studiu recent realizat de Seiliez și colaboratorii arată că atrofia miotuburilor de păstrăv mediată de miostatină in vitro este asociată cu o reglare ascendentă atât a sistemului ubiquitină–proteazom, cât și a sistemului autofagie–lizozom. Ținând cont că semnalizarea miostatinei la păstrăv este complexă, datorită celor patru paralogi ai miostatinei, această posibilă legătură miostatină–autofagie ar trebui confirmată în culturi primare de mușchi de mamifere.

Luate împreună, aceste rezultate sugerează o legătură între miostatină, autofagie și sistemul ubiquitină–proteazom. Sunt necesare experimente suplimentare pentru a clarifica rolul miostatinei în reglarea căii AKT și a sistemelor proteolitice celulare în timpul proteolizei musculare.

Concluzie

În ultimii ani, miostatina a devenit un mediator-cheie în răspunsul mușchiului la stimulii anabolici și catabolici. Miostatina reglează negativ activitatea căii AKT și acționează ca un repressor al inițierii translației. Deși există dovezi privind necesitatea miostatinei în reglarea sintezei proteinelor, rolul său în declanșarea degradării proteinelor nu este evident. Miostatina scade fosforilarea AKT și semnalează prin factorii de transcripție FOXO pentru a induce atrofia, însă mecanismele prin care miostatina reglează sistemele proteolitice necesită investigații suplimentare.

În plus, pentru a înțelege efectul miostatinei asupra sintezei proteinelor, ar fi interesant de stabilit dacă reglarea particulară a mecanismului de translație de către miostatină implică translația selectivă a anumitor ARNm. De asemenea, efectul miostatinei asupra capacității de translație, cum ar fi reglarea biogenezei ARNr, rămâne în mare parte neexplorat. Aceste aspecte sunt esențiale pentru dezvoltarea de medicamente sau tratamente care să inhibe calea de semnalizare a miostatinei.

By. Bitanu-Alexandru Sebastian-Alin

Referinte:

Ruegg MA, Glass DJ. Molecular mechanisms and treatment options for muscle wasting diseases. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2011;51:373–395.
Glass DJ. Skeletal muscle hypertrophy and atrophy signaling pathways. Int J Biochem Cell Biol. 2005;37(10):1974–1984.
Sandri M. Signaling in muscle atrophy and hypertrophy. Physiology (Bethesda) 2008;23:160–170.
Elliott B, Renshaw D, Getting S, Mackenzie R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiol (Oxf) 2012;205(3):324–340.
McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature. 1997;387(6628):83–90.
Mosher DS, Quignon P, Bustamante CD, et al. A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs. PLoS Genet. 2007;3(5):e79.
Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, et al. A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet. 1997;17(1):71–74.
Kambadur R, Sharma M, Smith TP, Bass JJ. Mutations in myostatin (GDF8) in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle. Genome Res. 1997;7(9):910–916.
Clop A, Marcq F, Takeda H, et al. A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep. Nat Genet. 2006;38(7):813–818.
Schuelke M, Wagner KR, Stolz LE, et al. Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child. N Engl J Med. 2004;350(26):2682–2688.
Szabo G, Dallmann G, Muller G, et al. A deletion in the myostatin gene causes the compact (Cmpt) hypermuscular mutation in mice. Mamm Genome. 1998;9(8):671–672.
Grobet L, Pirottin D, Farnir F, et al. Modulating skeletal muscle mass by postnatal, muscle-specific inactivation of the myostatin gene. Genesis. 2003;35(4):227–238.
Whittemore LA, Song K, Li X, et al. Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle mass and strength. Biochem Biophys Res Commun. 2003;300(4):965–971.
Rebbapragada A, Benchabane H, Wrana JL, et al. Myostatin signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathway to block adipogenesis. Mol Cell Biol. 2003;23(20):7230–7242.
Lee SJ, McPherron AC. Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98(16):9306–9311.
Derynck R, Zhang Y, Feng XH. Smads: transcriptional activators of TGF-beta responses. Cell. 1998;95(6):737–740.
Forbes D, Jackman M, Bishop A, et al. Myostatin auto-regulates its expression by feedback loop through Smad7 dependent mechanism. J Cell Physiol. 2006;206(1):264–272.
Zhu X, Topouzis S, Liang LF, Stotish RL. Myostatin signaling through Smad2, Smad3 and Smad4 is regulated by the inhibitory Smad7 by a negative feedback mechanism. Cytokine. 2004;26(6):262–272.
Sartori R, Milan G, Patron M, et al. Smad2 and 3 transcription factors control muscle mass in adulthood. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;296(6):C1248–C1257.
Trendelenburg AU, Meyer A, Rohner D, et al. Myostatin reduces Akt/TORC1/p70S6K signaling, inhibiting myoblast differentiation and myotube size. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;296(6):C1258–C1270.
Sartori R, Schirwis E, Blaauw B, et al. BMP signaling controls muscle mass. Nat Genet. 2013;45(11):1309–1318.
Liu W, Thomas SG, Asa SL, et al. Myostatin is a skeletal muscle target of growth hormone anabolic action. J Clin Endocrinol Metab. 2003;88(11):5490–5496.
Brill KT, Weltman AL, Gentili A, et al. Single and combined effects of growth hormone and testosterone administration on measures of body composition, physical performance, mood, sexual function, bone turnover, and muscle gene expression in healthy older men. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(12):5649–5657.
Mendler L, Baka Z, Kovacs-Simon A, Dux L. Androgens negatively regulate myostatin expression in an androgen-dependent skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun. 2007;361(1):237–242.
Braga M, Bhasin S, Jasuja R, et al. Testosterone inhibits transforming growth factor-beta signaling during myogenic differentiation and proliferation of mouse satellite cells: potential role of follistatin in mediating testosterone action. Mol Cell Endocrinol. 2012;350(1):39–52.
Dubois V, Laurent MR, Sinnesael M, et al. A satellite cell-specific knockout of the androgen receptor reveals myostatin as a direct androgen target in skeletal muscle. FASEB J. 2014.
Kim JS, Cross JM, Bamman MM. Impact of resistance loading on myostatin expression and cell cycle regulation in young and older men and women. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005;288(6):E1110–E1119.
Michel RN, Dunn SE, Chin ER. Calcineurin and skeletal muscle growth. Proc Nutr Soc. 2004;63(2):341–349.
Ruas JL, White JP, Rao RR, et al. A PGC-1alpha isoform induced by resistance training regulates skeletal muscle hypertrophy. Cell. 2012;151(6):1319–1331.
Roth SM, Martel GF, Ferrell RE, et al. Myostatin gene expression is reduced in humans with heavy-resistance strength training: a brief communication. Exp Biol Med (Maywood) 2003;228(6):706–709.
Willoughby DS. Effects of an alleged myostatin-binding supplement and heavy resistance training on serum myostatin, muscle strength and mass, and body composition. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 2004;14(4):461–472.
Willoughby DS. Effects of heavy resistance training on myostatin mRNA and protein expression. Med Sci Sports Exerc. 2004;36(4):574–582.
Hayot M, Rodriguez J, Vernus B, et al. Myostatin up-regulation is associated with the skeletal muscle response to hypoxic stimuli. Mol Cell Endocrinol. 2011;332(1–2):38–47.
Yarasheski KE, Bhasin S, Sinha-Hikim I, et al. Serum myostatin-immunoreactive protein is increased in 60–92 year old women and men with muscle wasting. J Nutr Health Aging. 2002;6(5):343–348.
Ratkevicius A, Joyson A, Selmer I, et al. Serum concentrations of myostatin and myostatin-interacting proteins do not differ between young and sarcopenic elderly men. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2011;66(6):620–626.
Siriett V, Platt L, Salerno MS, et al. Prolonged absence of myostatin reduces sarcopenia. J Cell Physiol. 2006;209(3):866–873.
Murphy KT, Koopman R, Naim T, et al. Antibody-directed myostatin inhibition in 21-mo-old mice reveals novel roles for myostatin signaling in skeletal muscle structure and function. FASEB J. 2010;24(11):4433–4442.
Kawada S, Tachi C, Ishii N. Content and localization of myostatin in mouse skeletal muscles during aging, mechanical unloading and reloading. J Muscle Res Cell Motil. 2001;22(8):627–633.
Baumann AP, Ibebunjo C, Grasser WA, Paralkar VM. Myostatin expression in age and denervation-induced skeletal muscle atrophy. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2003;3(1):8–16.
Carlson CJ, Booth FW, Gordon SE. Skeletal muscle myostatin mRNA expression is fiber-type specific and increases during hindlimb unloading. Am J Physiol. 1999;277(2 Pt 2):R601–R606.
Oldham JM, Osepchook CC, Jeanplong F, et al. The decrease in mature myostatin protein in male skeletal muscle is developmentally regulated by growth hormone. J Physiol. 2009;587(Pt 3):669–677.
Ohsawa Y, Hagiwara H, Nakatani M, et al. Muscular atrophy of caveolin-3-deficient mice is rescued by myostatin inhibition. J Clin Invest. 2006;116(11):2924–2934.
Gilson H, Schakman O, Combaret L, et al. Myostatin gene deletion prevents glucocorticoid-induced muscle atrophy. Endocrinology. 2007;148(1):452–460.
Salehian B, Mahabadi V, Bilas J, et al. The effect of glutamine on prevention of glucocorticoid-induced skeletal muscle atrophy is associated with myostatin suppression. Metabolism. 2006;55(9):1239–1247.
Zimmers TA, Davies MV, Koniaris LG, et al. Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin. Science. 2002;296(5572):1486–1488.
Durieux AC, Amirouche A, Banzet S, et al. Ectopic expression of myostatin induces atrophy of adult skeletal muscle by decreasing muscle gene expression. Endocrinology. 2007;148(7):3140–3147.
Amirouche A, Durieux AC, Banzet S, et al. Down-regulation of Akt/mammalian target of rapamycin signaling pathway in response to myostatin overexpression in skeletal muscle. Endocrinology. 2009;150(1):286–294.
McMahon CD, Popovic L, Oldham JM, et al. Myostatin-deficient mice lose more skeletal muscle mass than wild-type controls during hindlimb suspension. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003;285(1):E82–E87.
Bischoff R, Heintz C. Enhancement of skeletal muscle regeneration. Dev Dyn. 1994;201(1):41–54.