POSIBILUL ROL AL CREATINEI ÎN SÂNGE – DIMINUAREA DAUNELOR OXIDATIVE ASUPRA ERITROCITELOR ȘI LIMFOCITELOR

Introducere

Creatina este un acid carboxilic azotat care este produs endogen la vertebrate sau ingerat din surse exogene, precum peștele sau carnea. Aportul alimentar constituie aproximativ 50% din cantitatea totală de creatină din organismul uman și este de 1–5 grame pe zi în cazul unei alimentații omnivore. Creatina este sintetizată în două etape din trei aminoacizi: arginină, glicină și metionină. Sinteza creatinei începe în rinichi și pancreas, din arginină și glicină. Guanidinoacetatul produs este transportat către ficat, unde este metilat pentru a forma creatină, care este apoi exportată activ către țesuturi, precum mușchii, unde este necesară din punct de vedere energetic. Aproape 90–95% din cantitatea totală de creatină din organismul uman este stocată în mușchii scheletici, care preiau creatina împotriva unui gradient de concentrație cu ajutorul transportorului de creatină de tip 1 dependent de sodiu . În mod normal, mușchii mențin un gradient ridicat de concentrație a creatinei, care este de 500–1000 de ori mai mare în interiorul mușchilor decât în plasmă. În mușchi, 60% din creatină este transformată în fosfocreatină de către creatin-kinază, utilizând ATP drept donor al grupării fosfat. În condiții de necesar energetic acut, fosfocreatina transferă rapid gruparea sa fosfat înapoi către ADP, restabilind nivelurile de ATP . Astfel, în mușchi, creatina reprezintă, împreună cu ATP, rezerva fundamentală de energie.

În prezent, consumul alimentar de suplimente cu creatină este în creștere. Creatina este un amplificator eficient al energiei, îmbunătățește performanța fizică, crește masa corporală slabă și rezistența musculară . Poate fi administrată în siguranță în cantități relativ mari, de câteva grame pe zi, de către persoanele sănătoase, fără a produce efecte toxice. Prin urmare, creatina este extrem de populară ca supliment ergogenic în industria sportului și este utilizată pe scară largă de sportivi. Chiar și persoanele care fac exerciții recreaționale și vârstnicii consumă creatină în speranța îmbunătățirii activității fizice. Administrarea orală a unor doze mari de creatină crește suplimentar cantitatea intracelulară de creatină și rezerva de fosfocreatină din mușchi și ser.

Pe lângă utilizarea sa ca ajutor ergogenic, suplimentarea cu creatină atrage tot mai multă atenție deoarece prezintă beneficii promițătoare ca terapie adjuvantă în mai multe afecțiuni patologice . S-a demonstrat că creatina este benefică în prevenirea și/sau tratamentul bolilor neurodegenerative, al sclerozei laterale amiotrofice, artritei, distrofiei musculare, precum și al tulburărilor cardiovasculare și metabolice. Creatina îmbunătățește sensibilitatea la insulină și crește absorbția glucozei în celulele musculare. Bender și colaboratorii au raportat că suplimentarea cu creatină a dus la o viață mai sănătoasă și mai lungă la șoareci.

Creatina prezintă, de asemenea, activitate antioxidantă atât în sisteme acelulare, cât și în sisteme celulare. S-a demonstrat că creatina este eficientă în neutralizarea directă a unei game de radicali, inclusiv ABTS+, anion superoxid și peroxinitrit. Ulterior, Sestili și colaboratorii au arătat că creatina a avut, de asemenea, un efect celular protector împotriva a trei agenți oxidanți în mai multe linii celulare de mamifere. Persoanele cu sindrom de deficit de creatină prezintă un stres oxidativ crescut și apoptoză indusă de speciile reactive de oxigen. Recent, s-a demonstrat că creatina protejează rinichii șobolanilor împotriva leziunilor provocate de agentul anticancerigen cisplatină, despre care se știe că produce nefrotoxicitate prin generarea de radicali liberi. Cu toate acestea, există mai multe rapoarte care fie nu au identificat nicio proprietate antioxidantă, fie nu au găsit vreun rol al acesteia în efectele benefice ale creatinei . Prin urmare, proprietatea antioxidantă a creatinei rămâne o problemă controversată și trebuie examinată mai detaliat.

Creatina este prezentă în eritrocitele normale la o concentrație de 0,2 până la 0,5 mM. Concentrația sa scade odată cu îmbătrânirea eritrocitelor și a fost utilizată ca indicator al vârstei celulare și pentru estimarea proceselor hemolitice . Absorbția creatinei în eritrocite are loc printr-un mecanism dependent de sodiu, localizat în membrană, iar concentrația sa celulară este de zece ori mai mare decât cea din plasmă . Spre deosebire de mușchi și țesutul nervos, unde are un rol esențial în metabolismul energetic, nu există o funcție biologică clară a creatinei în eritrocite. În acest studiu am investigat eficiența creatinei în protejarea eritrocitelor și limfocitelor umane împotriva leziunilor oxidative în condiții in vitro. Eritrocitele sunt extrem de susceptibile la leziuni oxidative datorită concentrației celulare ridicate de ioni ai metalelor de tranziție, oxigen molecular și oxihemoglobină, un potențator potențial puternic al proceselor oxidative. Pentru a extinde studiile noastre la celulele sanguine nucleate, limfocitele umane au fost, de asemenea, tratate cu un agent oxidant în absența și în prezența creatinei. Limfocitele sunt celule imunitare cunoscute ca sursă atât de agenți oxidanți, cât și de compuși proinflamatori necesari pentru susținerea funcțiilor lor. Capacitatea de a face față stresului oxidativ depinde de mecanisme de protecție fie endogene, fie furnizate prin alimentație. Prin urmare, este important să se mențină nivelurile de antioxidanți, homeostazia redox și, implicit, funcția limfocitelor . Rezultatele noastre arată că creatina este un citoprotector eficient și atenuează leziunile induse de agenții oxidanți atât în eritrocite, cât și în limfocite.

Materiale și metode

Substanțe chimice

Peroxidul de hidrogen, creatina, creatinina, tris, S-acetiltiocolin iodura, acidul tiobarbituric, HiSep 1077, acidul tricloracetic și bromura de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu au fost achiziționate de la Himedia Laboratories, Mumbai, India. Ouabaina, diclorhidratul de 2,2′-azobis 2-amidinopropan, acidul metafosforic, mediul RPMI-1640 și 1-cloro-2,4-dinitrobenzenul au fost obținute de la Sigma-Aldrich, SUA. Glutationul redus, 2,4-dinitrofenilhidrazina și acidul 5,5’-ditio-bisnitrobenzoic, bromura de etidiu, agaroză și Triton X-100 au fost procurate de la Sisco Research Laboratory, Mumbai, India. Toate celelalte substanțe chimice au fost de grad analitic.

Izolarea eritrocitelor din sângele uman

Au fost utilizați ca donatori voluntari tineri, cu vârste între 22 și 30 de ani, sănătoși și nefumători, după obținerea consimțământului lor informat și scris. Întregul studiu, inclusiv metodele utilizate, a fost analizat și aprobat în mod specific de Comitetul Instituțional de Etică al Universității Musulmane Aligarh, care monitorizează cercetările ce implică subiecți umani. Sângele a fost recoltat în tuburi cu heparină și utilizat imediat. Acesta a fost centrifugat la 2000 rpm timp de 10 minute la 4°C într-o centrifugă clinică, iar supernatantul a fost îndepărtat. Sedimentul de eritrocite a fost spălat de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat și resuspendat în aceeași soluție pentru a obține un hematocrit de 10%.

Tratarea eritrocitelor, determinarea hemolizei și prepararea lizatelor

Eritrocitele au fost tratate separat cu agenții oxidanți AAPH sau peroxid de hidrogen, numai cu creatină sau creatinină și cu agent oxidant în prezența creatinei sau creatininei. Stresul oxidativ a fost indus prin incubarea suspensiilor de eritrocite de 10% la 37°C cu 50 mM AAPH timp de 4 ore sau cu 5 mM peroxid de hidrogen timp de 2 ore. În eritrocitele tratate cu peroxid de hidrogen, s-a adăugat azidă de sodiu 1 mM pentru inhibarea activității catalazei. În grupul tratat cu agent oxidant plus creatină sau creatinină, eritrocitele au fost incubate mai întâi cu creatină sau creatinină în concentrații de 5, 10, 15 sau 20 mM timp de 30 de minute, după care s-a adăugat agentul oxidant pentru perioada de timp indicată. În grupul tratat numai cu creatină sau creatinină, eritrocitele au fost incubate la 37°C cu creatină sau creatinină în concentrații de 15 sau 20 mM. După aceste incubări, suspensiile de eritrocite au fost centrifugate la 2500 rpm timp de 10 minute la 4°C. Supernatanții au fost păstrați, iar absorbția acestora a fost înregistrată la 540 nm pentru determinarea eliberării hemoglobinei. Sedimentele celulare au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat, iar eritrocitele au fost lizate cu zece volume de tampon hipotonic la 4°C timp de 2 ore. Probele au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 10 minute la 4°C, iar supernatanții au fost congelați rapid în alicote și utilizați ulterior pentru analize suplimentare.

Hemoglobina din lizatele celulare a fost determinată prin metoda cianmethemoglobinei, folosind reactivul Drabkin. Oxidarea hemoglobinei în methemoglobină a fost determinată spectrofotometric pe baza absorbanței hemolizatelor la 560, 576 și 630 nm [28].

Izolarea limfocitelor umane, tratarea cu peroxid de hidrogen și prepararea lizatelor celulare

Sângele uman a fost amestecat cu soluție salină normală și Histopaque 1077 în proporții de 3:3:2. Amestecul a fost centrifugat la 2400 rpm timp de 20 de minute, iar stratul alb intermediar, bogat în limfocite, a fost îndepărtat. Celulele au fost sedimentate prin centrifugare la 2400 rpm, spălate de trei ori și resuspendate în soluție salină normală pentru a obține o suspensie celulară de 5%, care a fost utilizată în experimentele ulterioare.

Limfocitele au fost incubate separat cu peroxid de hidrogen, numai cu creatină și cu agent oxidant în prezența creatinei. Azida de sodiu 1 mM a fost adăugată suspensiei celulare înainte de incubarea cu peroxid de hidrogen pentru inhibarea activității catalazei. Stresul oxidativ a fost indus prin adăugarea a 5 mM peroxid de hidrogen și incubarea timp de 2 ore la 37°C. În grupul creatină plus peroxid de hidrogen, limfocitele au fost incubate mai întâi cu 10, 15 sau 20 mM creatină timp de 30 de minute la 37°C, după care s-au adăugat 5 mM peroxid de hidrogen și s-a continuat incubarea încă 2 ore. În grupul tratat numai cu creatină, limfocitele au fost incubate cu 20 mM creatină la 37°C timp de 30 de minute. Grupul martor nu a primit niciun tratament, însă celulele au fost incubate la 37°C timp de 2 ore. După aceste tratamente, limfocitele au fost microcentrifugate la 12.000 rpm, sedimentele celulare au fost spălate de trei ori cu soluție salină normală, iar limfocitele au fost lizate cu 10 volume de tampon de liză care conținea 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA și 20 mM Tris-HCl, la pH 7,4, și incubate timp de 20 de minute la 4°C. Probele au fost din nou microcentrifugate timp de 10 minute la 12.000 rpm, iar supernatanții au fost congelați rapid în alicote pentru studiile ulterioare. Concentrația proteinelor din lizate a fost determinată prin metoda Lowry, utilizând albumina serică bovină drept standard [29].

Viabilitatea celulară

Viabilitatea limfocitelor izolate a fost verificată prin testul de excludere cu albastru de tripan [30] și s-a constatat că este de peste 93%.

Testul MTT a fost efectuat pentru studierea viabilității celulare relative în grupurile tratate. Soluțiile stoc de MTT au fost preparate în soluție salină tamponată cu fosfat și 10 μl au fost adăugați la 1 ml de probe de limfocite, urmat de incubare timp de 3 ore la 37°C. Probele au fost microcentrifugate la 12.000 rpm timp de 5 minute, sedimentul celular a fost spălat cu soluție salină tamponată cu fosfat, apoi s-a adăugat 1 ml de dimetilsulfoxid. Absorbanța formazanului albastru a fost determinată la 570 nm.

Malondialdehidă, conținutul de grupări carbonil și glutation redus

Malondialdehida, un produs al peroxidării lipidice, a fost măsurată sub forma substanțelor reactive cu acidul tiobarbituric. Absorbanța cromoforului roz produs în timpul reacției dintre acidul tiobarbituric și malondialdehidă a fost măsurată la 535 nm. Conținutul de grupări carbonil din lizate a fost determinat ca indicator al oxidării proteinelor. Grupările carbonil ale proteinelor reacționează cu 2,4-dinitrofenilhidrazina, formând un aduct a cărui absorbanță a fost înregistrată la 360 nm. Concentrația glutationului redus a fost determinată pe baza reacției sale cu acidul 5,5’-ditio-bisnitrobenzoic, după precipitarea proteinelor din lizatele celulare cu acid metafosforic.

Enzime antioxidante și capacitatea antioxidantă

Starea și capacitatea antioxidantă a lizatelor celulare au fost determinate pe baza testului capacității antioxidante de reducere a fierului și a testelor cu 2,2-difenil-1-picrilhidrazil. Enzimele antioxidante superoxid dismutaza Cu, Zn și glutation peroxidaza au fost determinate pe baza inhibării autooxidării pirogalolului și, respectiv, a scăderii absorbanței la 340 nm în timpul conversiei fosfatului de dinucleotidă de nicotinamidă și adenină redus în forma oxidată.

Determinarea enzimelor asociate membranei

Activitatea Na⁺, K⁺-ATPazei a fost măsurată pe baza diferenței dintre fosfatul anorganic eliberat din ATP în prezența și în absența ouabainei. Acetilcolinesteraza a fost determinată spectrofotometric folosind iodura de S-acetiltiocolină drept substrat, în prezența acidului 5,5’-ditio-bisnitrobenzoic. Absorbanța anionului de tionitrobenzoat produs în reacție a fost măsurată la 410 nm.

Microscopie electronică de scanare

Eritrocitele, 30 μl dintr-un hematocrit de 10%, au fost fixate cu glutaraldehidă 2,5% timp de 2 ore și apoi centrifugate la 1500 rpm. Sedimentul celular a fost spălat de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat și resuspendat în același tampon. O picătură de probă a fost întinsă pe plăci de sticlă, uscată la aer la 37°C și apoi spălată cu etanol și apă distilată. Probele au fost acoperite cu aur și apoi examinate la microscopul electronic de scanare la o mărire de 1000x.

Testul comet

Electroforeza pe gel de celulă unică, sau testul comet, a fost efectuată pentru evaluarea rupturilor catenelor de ADN din limfocite. Lamele de sticlă complet matuite au fost acoperite cu agaroză 1% și probe de limfocite. După liză, ADN-ul a fost lăsat să se desfășoare timp de 30 de minute la 4°C într-o soluție alcalină pentru electroforeză și ulterior a fost supus electroforezei timp de 20 de minute. În final, lamele au fost neutralizate, colorate cu bromură de etidiu și analizate la un microscop de fluorescență CX41 Olympus, Japonia. Cometele au fost evaluate la o mărire de 100x, iar imaginile a 50 de celule, 25 de pe fiecare lamă replicată, pentru fiecare probă au fost analizate. Lungimea cozii cometei și momentul Olive al cozii au fost alese ca parametri pentru evaluarea leziunilor ADN-ului nuclear și au fost generate automat de sistemul de analiză a imaginilor Komet 5.5, SUA.

Analiză statistică

Toate datele sunt exprimate ca medie ± eroarea standard a mediei. A fost efectuată o analiză a varianței cu o singură cale pentru determinarea semnificației variațiilor. A fost selectat un nivel de probabilitate de p<0,05, indicând semnificație statistică. Toate experimentele au fost repetate de cinci până la șase ori pentru a documenta reproductibilitatea.

Rezultate

Proprietatea antioxidantă a creatinei a fost studiată pe baza capacității sale de a proteja celulele împotriva leziunilor oxidative. Eritrocitele și limfocitele reprezintă modele convenabile datorită manipulării ușoare și disponibilității lor. Au fost utilizați inițial doi agenți oxidanți, AAPH și peroxidul de hidrogen, care generează tipuri diferite de radicali liberi. Au fost efectuate mai multe experimente preliminare, pe baza cărora eritrocitele au fost incubate cu 50 mM AAPH timp de 4 ore și cu 5 mM peroxid de hidrogen timp de 2 ore.

Hemoliza

A fost studiată mai întâi capacitatea creatinei de a proteja eritrocitele umane împotriva lizării celulare induse de AAPH și peroxid de hidrogen. Celulele au fost tratate cu agentul oxidant pentru perioada de timp dorită și apoi centrifugate. Liza celulară a fost determinată pe baza absorbanței supernatantului la 540 nm, datorată hemoglobinei eliberate din eritrocitele deteriorate. O hemoliză extinsă a fost indusă în prezența AAPH și a peroxidului de hidrogen administrate separat, în timp ce în celulele martor incubate la 37°C timp de 4 ore în absența agentului oxidant și a creatinei nu s-a observat nicio liză. Eritrocitele preincubate cu creatină și apoi expuse agenților oxidanți au prezentat o hemoliză mult redusă; acest efect protector al creatinei a fost dependent de doză. Nu s-a observat hemoliză atunci când eritrocitele au fost incubate cu 20 mM creatină, ceea ce arată că creatina, chiar și la concentrația ridicată utilizată în acest studiu, nu deteriorează celula.

Malondialdehidă, conținutul de grupări carbonil și glutation

Nivelurile glutationului, peroxidarea lipidică și oxidarea proteinelor sunt utilizate în mod obișnuit ca markeri ai inducerii stresului oxidativ în celule. Nivelul malondialdehidei, care este generată ca produs final în timpul oxidării lipidelor, a fost utilizat ca marker al peroxidării lipidice. Malondialdehida reacționează cu acidul tiobarbituric pentru a forma un produs roz care absoarbe la 535 nm. Stresul oxidativ determină, de asemenea, generarea de grupări carbonil în proteine, care pot fi cuantificate pe baza reacției lor cu 2,4-dinitrofenilhidrazina, rezultând formarea unui aduct hidrazonic care absoarbe la 360 nm.

Tratamentul eritrocitelor numai cu AAPH sau peroxid de hidrogen a crescut peroxidarea lipidică, după cum a fost demonstrat de nivelurile crescute de malondialdehidă. Oxidarea proteinelor a fost, de asemenea, crescută, rezultând un conținut mai mare de grupări carbonil în hemolizate. Acest lucru sugerează inducerea stresului oxidativ în celulă. Pretratarea eritrocitelor cu creatină le-a protejat împotriva peroxidării lipidice induse de AAPH, dar nu și împotriva celei induse de peroxidul de hidrogen. Oxidarea proteinelor, care a fost intensificată de ambii agenți oxidanți, a fost, de asemenea, mult redusă în prezența creatinei.

Glutationul este o tripeptidă care reprezintă principalul antioxidant neenzimatic al eritrocitelor și este prezent în celulă în concentrații milimolare. Nivelurile glutationului au fost reduse după incubarea eritrocitelor numai cu peroxid de hidrogen sau AAPH. Cu toate acestea, în prezența creatinei s-a observat o recuperare semnificativă a conținutului de glutation. Această reducere a nivelurilor glutationului indusă de AAPH și peroxidul de hidrogen indică din nou inducerea stresului oxidativ în eritrocite, fenomen care a fost redus de creatină.

Capacitatea antioxidantă și enzimele antioxidante

Superoxid dismutaza este o enzimă antioxidantă protectoare puternică, care neutralizează anionul superoxid prin catalizarea dismutării acestuia în peroxid de hidrogen și oxigen, în timp ce glutation peroxidaza catalizează transformarea peroxidului de hidrogen sau a peroxizilor organici în apă și, respectiv, alcool. Activitatea ambelor enzime a scăzut după expunerea eritrocitelor la peroxid de hidrogen, dar a fost protejată în prezența creatinei, în timp ce creatina administrată singură nu a avut niciun efect asupra activității enzimelor.

Capacitatea antioxidantă a celulei a fost determinată pe baza capacității de neutralizare a radicalilor liberi și de reducere a ionilor metalici, utilizând testele DPPH și FRAP, folosite pe scară largă. Activitatea de reducere a metalelor a fost determinată pe baza capacității hemolizatelor de a reduce ionii ferici la forma feroasă, utilizând testul FRAP. Tratamentul eritrocitelor cu oricare dintre agenții oxidanți administrați separat a redus capacitatea eritrocitelor de a reduce ionii ferici, dar această capacitate a fost restabilită în mare măsură de creatină. Activitatea de neutralizare a radicalilor DPPH a lizatelor a fost, de asemenea, redusă prin tratamentul numai cu agenți oxidanți, dar s-a recuperat atunci când creatina a fost prezentă în mediul de incubare.

Formarea methemoglobinei

O altă consecință a stresului oxidativ în eritrocite este oxidarea ionului feros din hem la forma ferică, transformând hemoglobina în methemoglobină. Formarea methemoglobinei este considerată un marker al stresului oxidativ eritrocitar. Tratamentul cu peroxid de hidrogen a crescut nivelurile de methemoglobină, ceea ce reduce capacitatea acestor celule specializate de a transporta oxigen. Nivelurile crescute de methemoglobină au fost reduse în mare măsură de creatină, într-o manieră dependentă de doză.

Enzime asociate membranei

Enzimele asociate membranei, Na⁺, K⁺-ATPaza și acetilcolinesteraza, au fost analizate pentru monitorizarea afectării membranei. Tratamentul eritrocitelor numai cu peroxid de hidrogen a dus la o reducere semnificativă a activității ambelor enzime în comparație cu grupul martor. Acest lucru sugerează afectarea membranei de către agentul oxidant. Cu toate acestea, prezența creatinei în amestecul de reacție a determinat recuperarea activității ambelor enzime, în timp ce creatina administrată singură nu a avut niciun efect asupra activității niciuneia dintre enzime.

Microscopie electronică de scanare

Imaginile obținute prin microscopie electronică de scanare ale eritrocitelor tratate cu peroxid de hidrogen au evidențiat modificări distincte ale morfologiei celulare. Celulele au prezentat modificări semnificative de formă, cu proiecții asemănătoare unor degete, adică echinocite, dezorganizarea membranei, formarea de vezicule membranare și pierderea formei biconcave. La unele celule grav deteriorate a fost observată și ruptura membranei. Pretratarea eritrocitelor cu creatină a protejat celulele împotriva deteriorării induse de peroxidul de hidrogen. În grupul creatină plus peroxid de hidrogen, suprafața celulară era netedă, cu o distribuție omogenă a celulelor și o formă biconcavă, demonstrând că creatina protejează eficient celulele împotriva deteriorării induse de peroxidul de hidrogen. Este important faptul că administrarea a 20 mM creatină nu a modificat singură morfologia celulară, aceasta fiind similară cu cea a eritrocitelor martor netratate.

Protecția oferită de creatinină

A fost studiată apoi eficiența creatininei în protejarea eritrocitelor împotriva stresului oxidativ indus de AAPH și peroxid de hidrogen. Incubarea eritrocitelor cu 50 mM AAPH sau 5 mM peroxid de hidrogen a crescut hemoliza eritrocitară și conținutul de grupări carbonil, a compromis capacitatea antioxidantă și a redus nivelurile glutationului. Pretratarea celulelor cu diferite concentrații de creatinină a redus aceste modificări într-o manieră dependentă de doză. Creatinina în sine nu a deteriorat eritrocitele, deoarece parametrii menționați mai sus din grupul tratat numai cu creatinină au fost similari cu valorile grupului martor.

Studii pe limfocite

A fost examinată apoi capacitatea creatinei de a proteja limfocitele umane împotriva deteriorării oxidative induse de peroxidul de hidrogen. Malondialdehida, conținutul de grupări carbonil ale proteinelor și alți parametri din limfocite au fost utilizați ca markeri ai stresului oxidativ și ai deteriorării celulare. Nivelurile de malondialdehidă din limfocite în grupul tratat numai cu peroxid de hidrogen au crescut semnificativ în comparație cu grupurile martor și tratat numai cu creatină. Cu toate acestea, nu a fost observată nicio diferență semnificativă statistic între nivelurile de malondialdehidă din grupul tratat numai cu 5 mM peroxid de hidrogen și grupul peroxid de hidrogen plus creatină, chiar și la concentrații mari de creatină.

Adăugarea a 5 mM peroxid de hidrogen a crescut grupările carbonil ale proteinelor, ale căror niveluri au fost semnificativ mai mari statistic decât cele din grupurile martor și tratat numai cu creatină; pretratarea limfocitelor cu creatină a atenuat această creștere. În mod similar, reducerea nivelurilor de glutation provocată de peroxidul de hidrogen a fost contracarată de creatină într-o manieră dependentă de doză. Capacitatea antioxidantă a limfocitelor a fost redusă considerabil prin tratamentul numai cu peroxid de hidrogen, dar a fost protejată de creatină într-o manieră dependentă de doză. Deteriorarea membranei limfocitelor a fost analizată pe baza activităților acetilcolinesterazei și Na⁺, K⁺-ATPazei. Pretratarea limfocitelor cu creatină a protejat semnificativ ambele enzime împotriva inactivării provocate de peroxidul de hidrogen.

Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul MTT. MTT este redus la un produs insolubil de formazan albastru de către enzima mitocondrială succinat dehidrogenază. Prin urmare, cantitatea de formazan produsă este direct proporțională cu numărul de celule vii. Așa cum era de așteptat, 5 mM peroxid de hidrogen a redus semnificativ viabilitatea limfocitelor în comparație cu probele martor. Tratamentele cu creatină au contracarat parțial citotoxicitatea provocată de peroxidul de hidrogen; 20 mM creatină a oferit o protecție bună împotriva distrugerii celulare induse de peroxidul de hidrogen.

Efectele genotoxice ale peroxidului de hidrogen și capacitatea protectoare a creatinei au fost examinate în limfocite utilizând testul comet. Din cauza deteriorării sau fragmentării ADN-ului, în grupurile tratate cu peroxid de hidrogen s-a observat un procent mai mare de ADN în regiunea cozii, evidențiat prin creșterea lungimii cozii cometei și a momentului Olive al cozii. Acest lucru indică un nivel crescut al rupturilor monocatenare ale ADN-ului și al situsurilor labile la alcalii în celulele tratate cu agentul oxidant. Pretratamentul celulelor cu creatină a redus semnificativ genotoxicitatea peroxidului de hidrogen și a determinat scăderea lungimii cozii cometei și a momentului Olive al cozii.

Discuții

Creatina este utilizată pe scară largă în industria sportului pentru îmbunătățirea performanței atletice. Efectele benefice ale suplimentării cu creatină sunt, de asemenea, recomandate într-o gamă largă de boli, dintre care multe implică o generare crescută de radicali liberi și specii reactive de oxigen. Studii recente au arătat că proprietatea antioxidantă a creatinei poate avea un rol benefic în acțiunea sa prin reducerea producției endogene de specii reactive de oxigen. Cu toate acestea, măsura în care proprietatea antioxidantă a creatinei contribuie la efectele sale citoprotectoare nu a fost studiată suficient și rămâne un subiect controversat. O modalitate de a aborda această problemă este expunerea celulelor la diferiți agenți oxidanți și apoi determinarea răspunsului acestora. În studiul de față am examinat rolul creatinei în protejarea celulelor sanguine umane împotriva leziunilor induse de agenți oxidanți. Eritrocitele și limfocitele au fost selectate pentru a reprezenta efectele asupra celulelor sanguine anucleate și nucleate.

Eritrocitele sunt cele mai abundente celule din sânge și conțin creatină, a cărei funcție în aceste celule este necunoscută. Eritrocitele nu au ADN, organite și mecanisme pentru sinteza proteinelor și, prin urmare, reprezintă un sistem celular simplu și convenabil pentru studierea leziunilor induse de substanțe toxice. Au fost selectați doi compuși diferiți care induc radicali liberi, peroxidul de hidrogen și AAPH, pentru a verifica versatilitatea creatinei ca antioxidant. AAPH se descompune producând radicali peroxil care inițiază reacțiile oxidative, în timp ce peroxidul de hidrogen este o specie reactivă de oxigen care nu este un radical, poate difuza prin membrane și poate reacționa cu metale active redox, precum fierul, pentru a genera radicalul hidroxil, care produce leziuni. Eritrocitele au fost expuse la peroxid de hidrogen și AAPH, în prezența și în absența creatinei. Au fost apoi determinați mai mulți parametri pentru a vedea dacă creatina poate atenua stresul oxidativ și leziunile celulare induse de agenții oxidanți în eritrocite.

Tratamentul eritrocitelor cu AAPH și peroxid de hidrogen a provocat leziuni celulare, cu o hemoliză de 20–30%, însă aceasta a fost prevenită într-o manieră dependentă de doză prin pretratarea celulelor cu creatină. Incubarea eritrocitelor cu oricare dintre agenții oxidanți a dus, de asemenea, la creșterea peroxidării lipidice. Radicalii peroxil generați de AAPH oxidează lipidele, provocând pierderea integrității membranei. Malondialdehida, unul dintre produșii finali ai peroxidării lipidice, poate, de asemenea, să formeze legături încrucișate între proteine și fosfolipide, determinând disfuncția membranei și reducerea supraviețuirii celulare. Peroxidarea lipidică indusă de AAPH a fost redusă în celulele pretratate cu creatină, indicând că aceasta poate proteja lipidele membranare împotriva oxidării. Cu toate acestea, creatina s-a dovedit ineficientă în reducerea peroxidării lipidice induse de peroxidul de hidrogen în eritrocite, în experimente repetate. Rezultate similare au fost obținute și de alți cercetători. Lawler și colaboratorii au constatat că creatina nu a protejat împotriva peroxidării lipidice induse de hidroperoxidul de terț-butil într-un sistem acelular. Suplimentarea cu creatină nu a redus nici peroxidarea lipidică indusă de exercițiu în ficatul și mușchii șobolanilor. Deoarece creatina protejează împotriva hemolizei induse de peroxidul de hidrogen, dar nu și împotriva peroxidării lipidice, acest lucru indică faptul că peroxidarea lipidică nu joacă un rol major în deteriorarea și liza celulară induse de peroxidul de hidrogen. În plus, efectul protector al creatinei asupra peroxidării lipidice induse de AAPH, dar nu și asupra celei induse de peroxidul de hidrogen, arată că mecanismul sau radicalul implicat în efectele peroxidative ale acestor doi agenți oxidanți este diferit în eritrocite.

Deteriorarea oxidativă duce adesea la pierderea funcției proteinelor din cauza oxidării acestora, proces care introduce grupări carbonil. Acumularea grupărilor carbonil proteice rezultă din deteriorarea oxidativă a scheletului proteic, oxidarea directă a lanțurilor laterale ale aminoacizilor sau legarea aldehidelor produse în urma peroxidării lipidice. Atât AAPH, cât și peroxidul de hidrogen au crescut conținutul de grupări carbonil, indicând o oxidare crescută a proteinelor din celulă. Creatina a fost capabilă să protejeze eritrocitele împotriva modificărilor și să prevină acumularea grupărilor carbonil. Acesta este primul exemplu în care s-a demonstrat că creatina protejează împotriva modificării oxidative a proteinelor. Acest lucru este important deoarece proteinele deteriorate oxidativ, în ciuda timpului lor de înjumătățire lung, nu sunt reparate și sunt în cele din urmă eliminate prin degradare proteolitică.

Creatina a atenuat, de asemenea, epuizarea nivelului de glutation provocată de peroxidul de hidrogen și AAPH. Glutationul funcționează ca un cofactor pentru diverse enzime metabolice, contribuie la transportul intracelular, acționează ca antioxidant, facilitează plierea și degradarea proteinelor și menține grupările tiol ale proteinelor membranare în formă redusă. Scăderea conținutului de glutation provoacă un dezechilibru al sistemului redox al celulei, ceea ce compromite capacitatea eritrocitelor de a face față unei creșteri generalizate a stresului oxidativ. Inducerea stresului oxidativ și epuizarea glutationului vor reduce, la rândul lor, capacitatea antioxidantă a celulei. Acest lucru a fost studiat prin utilizarea a două teste utilizate pe scară largă. Capacitatea de neutralizare a radicalilor liberi DPPH și activitatea de reducere a metalelor, în cazul ionilor Fe3+, determinate prin testele DPPH și FRAP, au fost afectate în urma tratării celulelor cu AAPH și peroxid de hidrogen. Cu toate acestea, acestea au fost restabilite într-o manieră dependentă de doză prin preîncărcarea eritrocitelor cu creatină. Această creștere a capacității antioxidante reprezintă o dovadă directă că stresul oxidativ a scăzut atunci când celulele au fost tratate cu creatină.

Experimentele suplimentare de protecție au utilizat exclusiv peroxid de hidrogen. Deteriorarea membranei, sugerată de experimentele de hemoliză, a fost, de asemenea, monitorizată prin activitatea enzimelor marker, acetilcolinesteraza și Na⁺, K⁺-ATPaza. Pierderea integrității membranei este monitorizată prin inhibarea Na⁺, K⁺-ATPazei, care menține gradientul de Na⁺ și K⁺ de-a lungul membranei plasmatice, gradient important pentru funcționarea celulei. Studiile au demonstrat o corelație între inhibarea acetilcolinesterazei din sânge și deteriorarea țesuturilor țintă. Activitățile Na⁺, K⁺-ATPazei și acetilcolinesterazei au scăzut în eritrocite în prezența peroxidului de hidrogen, dar pretratamentul cu creatină le-a restabilit în mare măsură către nivelurile grupului martor. Creatina a prevenit, de asemenea, inactivarea enzimelor antioxidante indusă de peroxidul de hidrogen.

Hemoglobina este o țintă majoră a speciilor reactive de oxigen în eritrocite datorită abundenței sale. O consecință este conversia fierului feros al hemoglobinei în forma ferică, rezultând methemoglobina, care este inactivă ca transportor de oxigen. Formarea methemoglobinei este, de fapt, considerată un marker al stresului oxidativ eritrocitar. Peroxidul de hidrogen a indus o stare de stres ridicat în eritrocite, în timp ce creatina a stabilizat forma feroasă a fierului din hem și a prevenit formarea methemoglobinei.

Rezultatele microscopiei electronice de scanare susțin puternic studiile noastre biochimice. Imaginile de microscopie electronică au arătat că peroxidul de hidrogen a provocat modificări morfologice ale eritrocitelor, de la forma discoidă la una echinocitară. Aceste modificări structurale se pot datora inserării unor molecule străine în stratul exterior sau interior al membranei eritrocitare. Creatina, la 20 mM, a fost foarte eficientă în protejarea eritrocitelor împotriva deteriorării induse de agentul oxidant și a restabilit în mare măsură morfologia eritrocitară. Suprafața celulară era netedă, fără proeminențe, iar forma semăna foarte mult cu cea a celulelor martor.

Limfocitele sunt celule ale sistemului imunitar implicate în apărarea organismului împotriva bolilor infecțioase și a materialelor străine. Spre deosebire de eritrocite, limfocitele sunt celule complete, deoarece conțin nucleu și alte organite celulare. Numărul leucocitelor din sânge este adesea un indicator al unei boli. Limfocitele au fost utilizate pentru evaluarea rolului creatinei ca antioxidant în protejarea celulelor nucleate împotriva deteriorării induse de agenții oxidanți. Rezultatele noastre arată că și creatina a protejat limfocitele împotriva deteriorării induse de agenții oxidanți, după cum s-a observat pe baza nivelurilor grupărilor carbonil proteice și ale glutationului. Și în acest caz, adăugarea creatinei la probe nu a redus peroxidarea lipidică, confirmând observațiile anterioare și rezultatele noastre actuale obținute la eritrocite. Creatina a protejat, de asemenea, membrana celulară a limfocitelor și a prevenit inactivarea Na⁺, K⁺-ATPazei și acetilcolinesterazei indusă de peroxidul de hidrogen. Creșterea activității Na⁺, K⁺-ATPazei din membrana limfocitelor crește cantitatea de Na⁺ din celulă, ceea ce ar duce la o creștere semnificativă a activității pompei. Modificările activității acetilcolinesterazei limfocitelor reflectă imunodeficiența asociată disfuncției celulare. Este important faptul că scăderea viabilității celulare indusă de peroxidul de hidrogen a fost, de asemenea, atenuată de creatină. Creatina a modulat deteriorarea ADN-ului indusă de peroxidul de hidrogen în limfocitele umane. Efectul genoprotector al creatinei a fost evaluat prin testul comet, în care creșterea lungimii cozii indică deteriorarea ADN-ului. Cantitatea de ADN care migrează în coadă, conferind astfel aspectul unei comete, ca urmare a tratamentului cu o substanță toxică, este corelată cu deteriorarea ADN-ului. Se consideră că peroxidul de hidrogen provoacă ruperea catenelor de ADN prin generarea radicalului hidroxil în apropierea moleculei de ADN, prin reacția Fenton, ceea ce duce la instabilitatea ADN-ului, mutageneză și, în cele din urmă, carcinogeneză. Limfocitele incubate numai cu peroxid de hidrogen au prezentat o fragmentare mai mare a catenelor de ADN în comparație cu celulele martor netratate sau cu celulele incubate numai cu creatină. Creatina la 20 mM a fost foarte eficientă în inhibarea ruperii catenelor de ADN provocată de peroxidul de hidrogen. Aceste rezultate oferă dovezi că și în limfocitele umane nucleate creatina poate funcționa ca antioxidant și poate proteja organitele celulare împotriva efectelor dăunătoare ale stării de stres oxidativ. În viitorul apropiat, va fi necesară investigarea căilor care sunt activate în limfocite după tratamentul cu creatină.

Efectele ergogenice ale suplimentării cu creatină au fost atribuite în principal rolului creatinei în sistemul energetic al mușchilor. Demonstrarea realizată de Lawler și colaboratorii că creatina prezintă proprietăți antioxidante a deschis posibilitatea ca cel puțin unele dintre efectele sale benefice la sportivi să se datoreze reducerii speciilor reactive de oxigen și a stresului oxidativ induse de exercițiu. Rezultatele noastre sugerează că suplimentarea cu creatină poate fi benefică și prin: reducerea acumulării de agenți oxidanți nu numai în mușchi, ci și în sânge și creșterea capacității sângelui de a transporta oxigen prin inhibarea transformării hemoglobinei în methemoglobină, care este inactivă ca transportor de oxigen. În urma încărcării cu creatină, creșterea concentrației acesteia este relativ mai mare în eritrocite decât în alte țesuturi. Protecția împotriva leziunilor oxidative oferită de creatină poate crește, de asemenea, durata de viață a celulelor, deoarece eritrocitele deteriorate sunt eliminate din circulație de către splină. Acest lucru va reduce stresul asupra măduvei osoase roșii necesar pentru producerea eritrocitelor de înlocuire. Există, de fapt, o corelație directă între nivelurile de creatină și durata de supraviețuire a eritrocitelor la pacienții cu hemoliză. Conținutul de creatină din celulele tinere este de 6–9 ori mai mare decât în cele îmbătrânite, iar nivelurile de creatină din eritrocite au fost folosite mult timp ca indice al vârstei celulare. Deoarece se consideră că speciile reactive de oxigen reglează durata de viață a eritrocitelor din sânge, concentrația scăzută de creatină va face eritrocitele îmbătrânite mai vulnerabile la deteriorarea oxidativă, ducând la eliminarea lor din circulație.

Efectele protectoare ale creatinei asupra eritrocitelor și limfocitelor pot fi atribuite activității sale antioxidante directe, prin neutralizarea radicalilor liberi și a speciilor reactive de oxigen induse de agenții oxidanți și/sau prin intensificarea sistemului celular de apărare antioxidantă enzimatică și neenzimatică, de exemplu prin atenuarea scăderii nivelurilor de glutation și a inactivării enzimelor antioxidante induse de agenții oxidanți. Efectele creatinei nu pot fi mediate prin influența sa asupra metabolismului energetic celular, deoarece eritrocitele și limfocitele nu conțin creatin-kinază și nu pot transforma creatina în fosfocreatină. Nici reducerea stresului oxidativ prin chelarea fierului nu este probabilă, deoarece creatina, spre deosebire de mulți antioxidanți precum compușii polifenolici vegetali, nu leagă fierul. Cu toate acestea, mecanismul exact prin care creatina își exercită activitatea antioxidantă rămâne de elucidat și ar trebui să constituie subiectul unor studii viitoare.

Creatinina, un produs secundar al metabolismului creatinei și fosfocreatinei, a fost de asemenea analizată pentru proprietățile sale antioxidante. Creatinina este prezentă în plasmă și în eritrocite și prezintă rezultate promițătoare, reducând deteriorarea oxidativă indusă de AAPH și peroxidul de hidrogen, aproape în aceeași măsură ca și creatina. În mod surprinzător, nu a existat niciun studiu care să examineze proprietățile antioxidante ale creatininei, iar rezultatele noastre reprezintă primul raport privind potențiala funcție antioxidantă a acestui compus. Deoarece creatinina are o structură foarte asemănătoare cu cea a creatinei, efectul său protector poate fi explicat, de asemenea, pe baza proprietăților antioxidante.

Deși concentrațiile de creatină utilizate în acest studiu sunt ridicate, concentrații similare au fost utilizate anterior și de alți cercetători. Aceștia atribuie acest lucru faptului că creatina este un antioxidant slab în comparație cu alți antioxidanți bine cunoscuți, precum polifenolii vegetali, vitaminele C și E, Trolox, glutationul etc., care sunt eficienți la concentrații mult mai mici, submilimolare, și împotriva unei game mai largi de radicali liberi și specii reactive de oxigen. Cu toate acestea, trebuie reținut și faptul că suplimentele cu creatină sunt adesea administrate în cantități mari, de 20–30 de grame pe zi timp de mai multe zile, și determină creșterea nivelurilor plasmatice de creatină, care pot ajunge la 2–3 mM, în timp ce concentrația creatinei în mușchi se situează în intervalul 20–40 mM. În plus, după cum au menționat Sestili și colaboratorii, creatina este o moleculă omniprezentă, „fiziologic prezentă în organism”, iar efectele sale vor fi astfel amplificate datorită asocierii sale pe termen lung cu componentele celulare. Prin urmare, efectele benefice ale creatinei pot fi mai importante decât cele ale multor antioxidanți vegetali, ceea ce îi poate îmbunătăți considerabil eficiența și eficacitatea în celulă.

Rolul creatinei ca antioxidant în sânge și capacitatea sa de a reduce la minimum hemoliza și formarea methemoglobinei pot avea, de asemenea, manifestări clinice importante. În eritrocitele deteriorate oxidativ, cu membrana celulară deteriorată sau ruptă, speciile reactive de oxigen generate ies din celule și au un potențial considerabil de a deteriora alte componente ale circulației. Cel mai important, există o reducere a capacității de încărcare și descărcare a oxigenului. Pacientul anemic suferă de hipoxie tisulară, consecința capacității reduse a sângelui de a transporta oxigen, de obicei din cauza formării methemoglobinei. Aportul insuficient de oxigen și nutrienți poate declanșa, de asemenea, procese precum infecțiile virale și bacteriene. Prin urmare, funcția antioxidantă a creatinei din sânge poate avea o importanță majoră pentru menținerea la un nivel minim a deteriorării oxidative a acestor celule.

Fluxul sanguin și, în special, circulația eritrocitelor în interiorul vaselor depind de capacitatea caracteristică a eritrocitelor de a se deforma atunci când sunt supuse unui stres de forfecare. Echinocitul este o formă de eritrocit cu o membrană celulară anormală, prevăzută cu proeminențe spinoase distribuite, întâlnită la pacienții cu uremie, deficit de piruvat-kinază, hipomagneziemie, hipofosfatemie și anemie hemolitică la alergătorii de distanță lungă. Este posibil ca echinocitoza să fie cauza anemiei hemolitice. S-a demonstrat, de asemenea, că aceste celule se dezvoltă in vivo în timpul hemodializei și dispar la sfârșitul procedurii; în timpul acestei proceduri se observă frecvent o creștere a vâscozității sângelui, care poate afecta circulația la pacienți. Morfologia eritrocitelor este legată de fiziopatologia bolii hepatice alcoolice, iar eritrocitele anormale sunt observate în astfel de situații. Presupunem că includerea creatinei în alimentație poate preveni apariția echinocitelor și poate contribui la un flux sanguin lin și neobstrucționat.

Proprietatea creatinei de a proteja ADN-ul împotriva deteriorării oxidative poate fi importantă în boli precum cancerul. Oamenii sunt expuși constant la agenți naturali care deteriorează ADN-ul, precum lumina solară, agenți alimentari precum carnea gătită, acrilamida etc. și radicalii liberi de oxigen formați endogen. Prin urmare, inducerea deteriorării ADN-ului este un proces fundamental și inevitabil, care joacă un rol esențial în dezvoltarea cancerului și în apariția defectelor genetice ereditare. Aceste mutații ale ADN-ului care se acumulează reprezintă cauza scăderii expresiei genelor și a pierderii capacității funcționale observate odată cu înaintarea în vârstă și pot fi atenuate de creatină.

Creatina poate avea, de asemenea, o potențială funcție în tulburările în care stresul oxidativ joacă un rol esențial în patogeneza bolii și în care acesta este crescut în sânge. Deteriorarea oxidativă este crescută la pacienții cu diabet zaharat din cauza unei apărări slăbite, determinată de reducerea antioxidanților endogeni precum glutationul redus și vitamina E. Se consideră că agresiunea oxidativă este mecanismul patogen care duce de la rezistența la insulină la diabetul manifest. Capacitatea creatinei de a preveni sau inversa stresul oxidativ poate fi importantă pentru utilitatea sa clinică și, prin urmare, suplimentarea cu creatină poate fi benefică la pacienții cu diabet. În anemia hemolitică există hemoliză intravasculară care eliberează conținutul eritrocitelor în fluxul sanguin. Aceasta include în mare parte compuși care conțin fier și care pot produce leziuni prin reacții Fenton, fenomen care poate fi redus prin suplimentarea cu creatină. Alte afecțiuni asociate cu un stres oxidativ crescut în sânge și în care suplimentarea cu creatină ar putea fi utilă sunt bolile neurodegenerative, precum boala Alzheimer, și bolile cardiovasculare.

Pierderea crescută de K⁺ este frecventă în mai multe afecțiuni ale globulelor roșii, sugerând că acest fenomen poate avea un rol direct în deteriorarea membranei. În situații precum îmbătrânirea eritrocitelor, eritrocitele cu deficit de piruvat-kinază și celulele cu modificări ireversibile de formă, modificările cationilor și ale apei sunt asociate cu epuizarea adenozin trifosfatului. Deoarece creatina contribuie la menținerea activității Na⁺, K⁺-ATPazei, aceasta poate fi administrată pentru a preveni pierderea de K⁺.

Concluzie

În concluzie, rezultatele noastre demonstrează clar că creatina poate proteja eficient eritrocitele și limfocitele umane împotriva deteriorării induse de agenții oxidanți. Ea previne oxidarea proteinelor, epuizarea glutationului și conversia hemoglobinei în methemoglobină. Creatina protejează, de asemenea, ADN-ul limfocitelor împotriva deteriorării oxidative și permite menținerea activității enzimelor mitocondriale chiar și în prezența unui agent oxidant. Această protecție poate fi atribuită proprietăților antioxidante intrinseci ale creatinei. Acesta este primul raport care sugerează o potențială funcție a creatinei în sânge și oferă, de asemenea, o explicație pentru motivul pentru care un conținut mai scăzut de creatină determină senescența globulelor roșii. Rezultatele noastre indică, de asemenea, că creatinina, considerată mult timp un produs final excretor al metabolismului creatinei, poate avea un rol protector similar în sânge. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a clarifica evenimentele moleculare exacte care stau la baza modului de acțiune al creatinei și al creatininei, pentru a exploata mai bine potențialul lor terapeutic și preventiv în timpul suplimentării.

By. Bitanu-Alexandru Sebastian-Alin

Referințe:

1. Wyss M, Kaddurah-Daouk R. Creatine and creatinine metabolism. Physiol Rev. 2000; 80: 1107–1213. pmid:10893433
2. Snow RJ, Murphy RM. Creatine and the creatine transporter: a review. Mol Cell Biochem. 2001; 224: 169–181. pmid:11693194
3. Walliman T, Tokarska-Schlattner, Schlattner U. The creatine kinase system and pleiotropic effects of creatine. Amino Acids. 2011; 40: 1271–1296. pmid:21448658
4. Demant TW, Rhodes FC. Effects of creatine supplementation on exercise performance. Sports Med. 1999; 28: 46–60.
5. Bemben MG, Lamont HS. Creatine supplementation and exercise performance: recent findings. Sports Med. 2005; 35: 107–125. pmid:15707376
6. Kim HJ, Kim CK, Carpentier A, Portmans JR. Studies on the safety of creatine supplementaion. Amino Acids. 2011; 40: 1409–1418. pmid:21399917
7. Clark JF. Creatine and phosphocreatine: a review of their use in exercise and sport. J Athl Train. 1997; 32: 45–51. pmid:16558432
8. Schedel JM, Tanaka H, Kiyonaga A, Shindo M, Schutz Y. Acute creatine ingestion in human: Consequences on serum creatine and creatinine concentrations. Life Sci. 1999; 65: 2463–2470. pmid:10622230
9. Gualano B, Roschel H, Lancha AH Jr, Brightbill CE, Rawson ES. In sickness and in health: the widespread application of creatine supplementation. Amino Acids. 2011; 43: 519–529. pmid:22101980
10. Persky AM, Brazeen GA, Hochhaus G. Pharmakokinetics of the dietary supplement creatine. Clin Pharmakokinet. 2003; 42: 557–574.
11. Tarnopolsky MA. Creatine as a therapeutic strategy for myopathies. Amino Acids. 2011; 40: 1397–1407. pmid:21399918
12. Ceddia RB, Sweeney G. Creatine supplementation increases glucose oxidation and AMPK phosphorylation and reduces lactate production in L6 skeletal muscle cells. J Physiol. 2004; 555: 409–421. pmid:14724211
13. Bender A, Beckers J, Schneider I, Holter SM, Haack T, Ruthsatz DM et al. Creatine improves health and survival of mice. Neurobiol Aging. 2008; 29: 1404–1411. pmid:17416441
14. Lawler JM, Barnes WS, Wu G, Song W, Demaree S. Direct antioxidant properties of creatine. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 290: 47–52. pmid:11779131
15. Sestili P, Martinelli C, Bravi G, Picolli G, Curci R. Creatine supplementation affords cytoprotection in oxidatively injured cultured mammalian cells via direct antioxidiant activity. Free Radic Biol Med. 2006; 40: 837–849. pmid:16520236
16. Alcaide P, Merinero B, Ruiz-Sala P et al. Defining the pathogenicity of creatine deficiency syndrome. Hum Mutat. 2011; 32: 282–291. pmid:21140503
17. Genc G, Okuyucu A, Meydan BC, Yavuz O, Nisbet O, Hokelek M et al. Effect of free creatine therapy on cisplatin-induced renal damage. Ren Fail. 2014; 36: 1108–1113. pmid:24845105
18. Aksentijevic D, Zervou S, Faller KME, McAndrew DJ, Schneider JE, Neubauer S et al. Myocardial creatine levels do not influence response to acute oxidative stress in isolated perfused heart. PLoS One. 2014; 9: e109021. pmid:25272153
19. Genius J, Geiger J, Bender A, Moller H-J, Klopstock T, Rujescu D. Creatine protects against excitotoxicity in an in vitro model of neuro degeneration. PLoS One. 2012; 7: e305554.
20. Juravleva E, Barbakadze T, Mikeladze D, Kekelidze T. Creatine enhances survival of glutatmate-treated neuronal/glial cells, modulates Ras/NF-kappa B signalling, and increases the generation of reactive oxygen species. J Neurosci Res. 2005; 79: 224–230. pmid:15578723
21. MacCormick VM, Hill LM, MacNeil L, Burke DG, Smith-Palmer T. Elevation of creatine in red blood cells in vegetarians and non vegetarians after creatine supplementation. Can J Appl Physiol. 2004; 29: 704–713. pmid:15630144
22. Jiao Y, Okumiya T, Saibara T, Tsubosaki E, Matsumura H, Park K et al. An enzymatic assay for erythrocyte creatine as an index of the erythrocyte life time. Clin Biochem. 1998; 31: 59–65. pmid:9622767
23. Bennett SE, Bevington A, Walls J. Regulation of intracellular creatine in erythrocytes and myoblasts: influence of uraemia and inhibition of Na⁺, K⁺-ATPase. Cell Biochem Func. 1994; 12: 99–106.
24. Fehr J, Knob M. Comparison of red cell creatine level and reticulocyte count in appraising the severity of hemolytic processes. Blood. 1979; 53: 966–976. pmid:435648
25. Cimen MY. Free radical metabolism in human erythrocytes. Clin Chim Acta. 2008; 390: 1–11. pmid:18243141
26. Larbi A, Kempf J, Pawelec G. Oxidative stress modulation and T cell activation. Exp Gerontol. 2007; 42: 852–858. pmid:17604927
27. Knight JA. Review: free radicals, antioxidants, and the immune system. Ann Clin Lab Sci. 2000; 30: 145–158. pmid:10807157
28. Benesch RE, Benesch R, Yung S. Equations for the spectrophotometric analysis of hemoglobin mixtures. Anal Biochem. 1973; 55: 245–248. pmid:4753150
29. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; 193: 265–275. pmid:14907713
30. Pool-Zoble BL, Guigas C, Klein RG, Neudecker CH, Renner HW, Schmezer P. Assessment of genotoxic effects by lindane. Food Chem Toxicol. 1993; 31: 271–283. pmid:7682977
31. Denizot F, Lang R. Rapid calorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 1986; 89: 271–277. pmid:3486233
32. Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1978; 52: 302–310. pmid:672633
33. Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz A et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 1990; 186: 464–478. pmid:1978225
34. Beutler E. Red Cell Metabolism. A Manual of Biochemical Methods. 3rd ed. Grune and Stratton, New York, USA; 1984.
35. Benzie IFF, Strain JJ. Ferric reducing ability of plasma as a measure of antioxidant power: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996; 239: 70–76. pmid:8660627
36. Mishra K, Ojha H, Chaudhury NK. Estimation of antiradical properties of antioxidants using DPPH· assay: a critical review and results. Food Chem. 2012; 130: 1036–1043.
37. Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 1974; 47: 469–474. pmid:4215654
38. Flohe L, Gunzler WA. Assays of glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 1984; 105: 114–121. pmid:6727659
39. Bonting S. Sodium-potassium activated adenosine triphosphatase and cation transport. In: Bitter EE, editor. Membrane and Iron Transport. Wiley-Inter Science London; 1970. pp. 257–363.
40. Ellman GL, Courtney DK, Andres V, Featherstone RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1964; 7: 88–95.
41. Falcieri E, Mariani AR, Del Coco R, Facchini A, Maraldi NM. A high yield technique for freeze facturing of small fractions of isolated cells. J Submicrose Cytol Pathol. 1988; 20: 623–627.
42. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 1998; 175: 184–191.
43. Sato Y, Kamo S, Takahashi T, Suzuki Y. Mechanism of free radical-induced hemolysis of erythrocytes: hemolysis by water-soluble radical initiator. Biochemistry. 1995; 34: 8940–8949. pmid:7619793
44. Araújo MB, Moura LP, Junior RC, Junior MC, Dalia RA, Sponton AC et al. Creatine supplementation and oxidative stress in rat liver. J Int Society Sports Nutr. 2013; 10: 54.
45. Guimaraes-Ferreira L, Pinheiro CHJ, Gerlinger-Romero F, Vitzel KF, Nachbar RT, Curi R et al. Short term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur J Appl Physiol. 2012; 12: 3905–3911.
46. Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzani A, Colombo R. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clinica Chim Acta. 2003; 329: 23–38.
47. Berlett BA, Stadtman ER. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem. 1997; 272: 20313–20316. pmid:9252331